Садржај
- фазе
- Метода 1 Идентификовање бактерије по Грамовој мрљи
- Метода 2 Извршите Зиехл-Неелсен тест обојења
- Метода 3 Проучите понашање и изглед бактерија
- Метода 4 Интерпретирати све резултате
Идентификација бактерија је сложен задатак. Један од разлога је тај што, према проценама, у свету постоји између 10 000 и милијарду врста бактерија! Правилно препознавање бактерија је веома важно, посебно у медицинском пољу, где правилно лечење болести у великој мери зависи од врсте микроба који узрокује проблем. У већини случајева идентификација се врши на основу елиминације. Да бисте препознали бактерију, морате извршити тестове бојења, анализирати њен изглед и посматрати како добро реагује на различита стања. Ако вам треба брз резултат, узмите ДНК узорак да бисте га послали у лабораторију.
фазе
Метода 1 Идентификовање бактерије по Грамовој мрљи
- одредити ако су бактерије Грам позитивне или негативне. Бојење по Граму је метода дељења бактерија између две најчешће врсте: грам-позитивне и грам негативне. Прве имају дебелу ћелијску стијенку која се састоји од полимера који се зове пептидогликан, а који има најбоље обојење као танки зидови грам-негативних бактерија.
- Неке уобичајене врсте грам-позитивних бактерија су стрептококи, стафилококи, микрококи (или микрококи) и листерије.
- Ево неколико уобичајених примера грам-негативних бактерија: Неиссериа, Ацинетобацтер, Моракелла, Ентеробацтериацеае, Вибрио, Хаемопхилус, Фусобацтериум и Цампилобацтер.
- Предузети одговарајуће заштитне мере. Бактерије и хемијски елементи које ћете користити током теста представљају ризик за ваше здравље. Носите заштитне наочаре, једнократне нитрилне рукавице и лабораторијски премаз приликом извођења теста бојења. Након што завршите, ставите рукавице и све остале контаминиране материјале у посебну кесу. Не заборавите да следите поступке у вашој лабораторији да бисте се решили врећица контаминираних производа.
- Ставите узорак на стаклени тобоган. Да бисте започели тест, ставите кап или бактеријски узорак на стерилни тобоган. Затим гурните сечиво преко Бунсенове горионице упаљене три пута да бисте учврстили узорак и спречили да излази са тањира када исперите или додате реагенсе.
- Додајте 5 капи љубичастог кристала у сечиво. Сипајте пет капи кристално љубичасте растворе на узорак. Сачекајте мало да узорак упије кристално љубичасту боју.
- Држите сечиво на месту са штипаљкама за одећу како не бисте запрљали руке.
- Темељито оперите сечиво да бисте уклонили мрљу. Употријебите славину или боцу и пустите да вода тече врло споро у трајању до пет секунди да бисте уклонили остатке мастила који се нису лијепили за узорак.
- Сипајте пет капи Грам диоде мрље на тобоган. То је раствор који се састоји од диоде, натријум бикарбоната и калијум диодида који узрокује стапање кристалне љубичице са ћелијским зидовима бактерија. Сипајте пет капи раствора на узорак и оставите да одстоји једну минуту.
- Оперите узорак алкохолом или млечном киселином. Алкохол и лацетон су средства за избељивање и елиминисаће мрље ћелија бактерија ако су по Граму негативне. Сипајте неколико капи избјељивача на узорак и оставите да дјелује не више од три секунде. Након тога, покушајте лагано испирати водом пет секунди да бисте уклонили та средства за избјељивање.
- Ако пустите да избјељивач дјелује дуже вријеме, то може резултирати нестанком бојања по грам-позитивним бактеријама, што резултира лажним негативним.
- Извршите контрастни тест са сафранином. Сафранин је црвена боја која је у контрасту с кристалном љубичицом, чиме обоји бактерије које не утичу љубичасто обојење. Сипајте око пет капи сафранина у узорак и оставите једну минуту. Након тога, покушајте лагано испрати водом пет секунди.
- Визуализујте узорак при 1000Кс увећању. Бактерије ће постати љубичасте или љубичасте ако је по Граму позитивно, или ружичасто ако је по Граф негативно због сафранина.
Метода 2 Извршите Зиехл-Неелсен тест обојења
- Овом техником откријте бактерије брзе киселине. Ове врсте садрже већу количину липида, што их чини отпорнијим на боје које се користе у бојењу по Граму. Киселине отпорне на бактерије припадају роду Мицобацтериум, који укључује бактерију одговорну за туберкулозу (М. туберцулосис). Да бисте обојили бактерију отпорну на киселину, морате користити црвену боју звану карболни фуксин, отпоран на испирање са раствором киселе или сумпорне киселине.
- Предузети одговарајуће заштитне мере. Хемијски и биолошки материјали који се користе током Зиехл-Неелсен-овог бојења могу бити опасни. Поред тога, морат ћете користити и извора топлоте, попут Бунсенове млазнице, електричног гријача или алкохолне лампе. Следите упутства испод да бисте обавили тест.
- Обуците наочаре, рукавице од нитрила и лабораторијски капут.
- Пазите да не удишете паре из боја и избјељивача и не дозволите да вам капљице попрскају очи или кожу. Контејнере држите отворенима под поклопцем.
- Будите врло опрезни приликом загревања сечива. Већина употријебљених хемикалија је запаљива. На тобоганима или другој опреми могу бити трагови запаљивих материја.
- Припремите сечиво. Кружним покретима равномерно распоредите малу количину узорка бактерија у центру стерилног клизача. Ваш узорак треба заузети око 10 мм до 20 мм.
- Осушите сечиво. Поставите сечиво на структуру за сушење с узорком окренутим према горе. Оставите да се природно осуши 30 секунди. Не покушавајте да осушите сечиво крпом.
- Осигурајте узорак топлином. Подигните узорак два или три пута преко упаљеног Бунсен горионика. Оштрицу можете поставити и на електрични грејач подешавањем температуре између 65 ° Ц и 75 ° Ц на најмање два сата. Пазите да узорак не прокуха или не запали.
- Додајте карболни фуксин у сечиво. Сипајте неколико капи овог раствора на тобоган. Сипајте довољно да у потпуности прекривате узорак.
- Загријте сечиво како бисте учврстили боју. Пажљиво загрејте клизач преко Бунсен горионика или алкохолне лампе, са узорком усмереним према горе, или га ставите на електрични грејач. Загријте сечиво на 60 ° Ц или док не почне да испушта паре. Пустите да боја делује пет минута.
- Ако користите електрични грејач, укључите га на 60 ° Ц. Ако се одлучите за алкохолну лампу или Бунсен горионик, требало би очекивати да ћете видети дим.
- Да оштрицу задржите на жељеној температури пет минута, повремено је загревајте.
- Пазите да узорак не прокуха, не изгори или осуши.
- Исперите сечиво хладном водом. Оставите да се охлади пет минута и лагано исперите неколико секунди чистом водом. Употребите воду из славине или исциједите боцу за уклањање мрља од боје које се нису пријањале на узорак.
- Сипајте на узорак кисели алкохол или сумпорна киселина. Користите запремину од 3 вол.% (В / в) алкохола или 20% сумпорне киселине да бисте у потпуности прекрили узорак. Оставите да киселина делује док боја не избледи и достигне веома светло ружичасту нијансу. Процес обично траје око десет минута.
- Користите чисту воду за испирање сечива. Нежно оперите сечиво испод славине или помоћу боце са притиском. Уклоните све остатке киселине и боје.
- Додајте контрастно средство. Након што сте испрали клизач, налијте боју малахит зелене или метилен плаве. Ова два решења стварају плавкасту или зеленкасту позадину на којој ће се појавити црвена боја, као и други биолошки материјали, попут људских ћелија и бактерија отпорних на киселине. Пустите да материје делују једну до две минуте.
- Исперите и осушите сечиво. Темељито исперите водом да бисте уклонили сувишни контраст. Након што завршите, осушите задњу страну сечива сувом крпом и оставите је да се природно осуши на постољу.
- Визуализујте узорак при 1000Кс увећању. Бактерије отпорне на киселину постаће црвене или тамно ружичасте. Остале бактерије, небактеријске ћелије и база сечива постаће зелена или плава.
Метода 3 Проучите понашање и изглед бактерија
- Анализирајте облик бактерија. Након обављања теста бојења како би се утврдило да ли су бактерије грам-позитивне, грам-негативне или киселоотпорне, време је да се прецизније идентификују врсте. Прво анализирајте облик бактерија на тобогану. Три најчешћа облика су кокци (сферни), спирале и бацили (облик штапа).
- Постоји неколико варијанти ових облика. Бактерије округлог облика (кокци), на пример, могу се појавити у пару (диплококи), у ланцима, хрпама или у групама од четири (тетраде).
- Сазнајте је ли бактерија аеробна или анаеробна. Узми два узорка бактерија и створи две одвојене културе. Месец мора бити анаеробни (узгаја се без кисеоника), док други мора бити аеробни (узгајан кисеоником). Чувајте анаеробну културу на 35 ° Ц на месту без кисеоника најмање 48 сати пре него што посматрате раст.
- Ако бактерије расту у окружењу без кисеоника, али не и ако су изложене кисеонику, то значи да су анаеробне.
- Иако се развијају у окружењу са кисеоником, али не у недостатку кисеоника, аеробни су.
- Када се развију у оба окружења, говоримо о факултативним анаеробним бактеријама.
- Извршите тест покретљивости. Бактерија је покретна ако се може кретати сама са једном или више флагела. Степен покретљивости је веома важан у идентификацији одређених врста бактерија. Постоји неколико врста покретљивости, али најсигурнији и највидљивији начин је получврсти медијум.
- Направите културу за тест покретљивости. Припремите културу бактерија у бујону за културу. Следите доленаведена упутства како бисте припремили бунду по вашем избору.
- Култура се инокулира у получврсти агар за тестове покретљивости. Премажите део културе јухе стерилном иглом за инокулацију. Пажљиво посадите иглу у получврсте цеви дагара, као што је ТТЦ лагар, које сте припремили за тест. Игла мора да продре кроз 2/3 агара.
- Када завршите, пажљиво извадите иглу пазећи да не пређете границе зоне инокулације.
- Инкубирајте епрувету на 30 ° Ц током 48 сати.
- Прочитајте резултат теста. Агар за тест покретљивости поцрвењат ће у додиру са бактеријама. Ако су покретни, ова црвена или ружичаста нијанса шириће се по целој супстанци. У супротном, бојење ће бити ограничено на место убризгавања.
Метода 4 Интерпретирати све резултате
- Прикупите своје коментаре. Да бисте знали врсту бактерија, требате прикупити информације добијене из култура, тестова бојења и посматрања облика. Ако прегледавате пацијентове узорке, симптоми које они могу такође помоћи у одређивању одговарајуће врсте бактерија.
- На пример, ако тестови покажу да су бактерије грам-негативне, анаеробне, не-покретне и приметите симптоме као што су бол у трбуху, мучнина и повраћање код пацијента, вероватно је да пацијент пати од бактеријске инфекције. фрагилис.
- Потражите у бази података. На свету постоје хиљаде врста бактерија. Немогуће је све знати напамет. Вероватно ћете морати да се обратите клиничкој микробиолошкој књизи или онлајн бази података како бисте упоредили резултате испитивања са подацима о бактеријским врстама.
- Постоје сјајни мрежни ресурси за идентификацију бактерија, али већина ових база података доступна је на енглеском језику, укључујући Патрицбрц.орг и ГлобалРПх. Међутим, корисне информације и даље можете пронаћи на веб локацији ИНРА Интернатионал Мицробиал Ресоурце Центер.
- Урадите генетски тест да бисте знали тачне врсте бактерија. У неким ће случајевима можда требати идентифицирати врсте бактерија. Најбржи и најлакши начин је обављање ДНК теста. ДНК тестови су такође корисни за идентификацију бактерија отпорних на традиционалне облике бојења и културе. Данас су ДНК тестови на микроорганизме веома брзи и могу да буду спремни за мање од два сата.
- Ако немате приступ лабораторији која врши генетичко секвенцирање микроорганизама, пошаљите узорак бактерија специјализованој агенцији.